هدف:
شمارش میکرو ارگانیسم ها به روش بیشترین تعداد احتمالی MPN
مقدمه:
یکی از روش های مرسوم و مورد اعتماد برای شمارش باکتری های کلی فرم در نمونه های آبی استفاده از روش تخمیر چندلوله ای یا اصطلاحاً روش MPN است.
در این آزمون برای شمارش کلی فرم ها از محیط کشتی استفاده می شود که محتوی قند لاکتوز باشد. معمولاً از محیط لاکتوز براث (lactose broth) و یا محیط لوریل تریپتوز براث (lauryl tryptose broth) برای این منظور استفاده می شود. پس از تهیه محیط کشت آن را به مقادیر مناسب در لوله هایی توزیع می کنند. سپس مقدار معینی از نمونه به هر لوله وارد می شود یا اصطلاحاً تلقیح می گردد. سپس لوله ها برای مدت 24 ساعت و حداکثر 48 ساعت در دمای 35 درجه سانتیگراد قرار داده می شوند تا تخمیر لاکتوز در آن ها بررسی شود. برای بررسی تولید گاز در اثر تخمیر نیز قبل از استریل کردن لوله های محتوی محیط کشت در هر لوله یک لوله کوچک موسوم به لوله دورهام به صورت وارونه انداخته می شود.
در صورتی که باکتری کلی فرم باشد از تخمیر لاکتوز گاز CO2تولید می کند که مقداری از آن در لوله دورهام جمع می شود. البته می توان به جای بررسی تولید گاز به بررسی تولید اسید در لوله ها پرداخت. برای این منظور در زمان تهیه محیط کشت در آن مقداری معرف pH تحت عنوان bromocresol purple افزوده می شود. در اثر تولید اسید توسط باکتری در هر لوله محیط اسیدی می شود و رنگ معرف از ارغوانی به زرد تغییر می کند. تا اینجا مرحله احتمالی آزمون است. از آنجایی که در این مرحله علاوه بر کلی فرم ها باکتری های دیگری هم هستند که می توانند نتیجه ای مشابه کلی فرم ها بدهند در مرحله بعد لازم است حضور کلی فرم ها در هر یک از این لوله های مثبت تأیید شود.
برای این منظور از هر یک از لوله هایی که از نظر حضور کلی فرم مثبت هستند (احتمالاً در آن ها کلی فرم رشد کرده) به لوله های محتوی محیط کشت انتخابی تری به نام برلیان گرین براث (brilliant green bile lactose broth یا BG broth) منتقل می کنند. این محیط کشت دارای ترکیباتی از قبیل نمک های صفراوی و برلیان گرین است که رشد باکتری های غیر کلی فرمی که ممکن است در مرحله احتمالی نتیجه مثبت در لوله های را سبب شده باشند داده باشند را متوقف می کنند.
این لوله ها نیز به مدت ۲۴ ساعت و حداکثر ۴۸ ساعت در دمای 5/0±35 درجه قرار داده می شوند. رشد (کدورت) به همراه تولید گاز تأیید کننده حضور کلی فرم ها در لوله هایی است که از آن ها برای کشت در BG broth استفاده شده است (مرحله تأییدی). برای اطمینان از حضور کلی فرم ها در هر لوله از لوله های تأییدی و یا به عبارت دیگر انجام مرحله تکمیلی از هر یک از لوله های مثبت مرحله تأییدی با استفاده از لوپ سیمی روی محیط کشت جامد مک کانکی آگار یا محیط های مشابه از قبیل EMB agar کشت خطی داده می شود.
پس از ۲۴ساعت انکوبه گذرای در دمای 5/0±35 درجه سانتیگراد درصورتی که کلنی های کلی فرم ها که به رنگ قرمز تیره با یا بدون جلای فلزی و یا به رنگ صورتی هستند روی محیط دیده شوند به معنای اطمینان از حضور کلی فرم ها در لوله برلیان گرین که از آن انتقال انجام شده می باشد. کلنی های قرمز تیره را کلنی های تیپیک و کلنی های صورتی را کلنی های آتیپیک کلی فرم ها می خوانند.
طبق دستورالعمل Standard Methods ویرایش ۲۱ (چاپ ۲۰۰۵) برای اطمینان از هر پلیت چند کلنی کلی فرم انتخاب و جهت رنگ آمیزی گرم روی اسلنت های نوترینت آگار کشت می شوند. همچنین از هر یک از این کلنی ها به محیط کشت مرحله احتمالی تلقیح می شود و ایجاد کدورت به همراه گاز یا اسید بررسی می شود.
البته لازم به توضیح است که در اغلب آزمایشگاه ها تنها دو مرحله احتمالی و تأییدی انجام می شوند.
از آنجایی که این روش شمارش روشی آماری است که از قوانین احتمالات با توجه به نحوه توزیع نمونه در لوله های محیط کشت تبعیت می کند به آن روش MPN می گویند. این اصطلاح از حرف اول سه کلمه Most Probable Number به معنای حداکثر تعداد احتمالی گرفته شده است.
نحوه محاسبه تعداد کلی فرم ها در هر ۱۰۰ میلی لیتر نمونه مورد آزمایش به این صورت است که تعداد لوله های مثبت مرحله تأییدی (و درصورتی که مرحله احتمالی انجام شود تعداد پلیت های مثبت مرحله تکمیلی) در سری لوله ها ثبت می شود. سپس تعداد کلی فرم ها را با پیدا کردن این عدد (کد) در جدولی موسوم به جدول MPN (و یا در برخی موارد با استفاده از فرمول هایی خاص که درمورد برخی روش های MPN در دسترس است) به دست می آورند. این عدد حداکثر تعداد کلی فرم ها در ۱۰۰ میلی لیتر نمونه آبی بوده و واحد آن به صورت MPN Index/100mL نوشته می شود.*
معمولا این روش برای خانواده ی انتروباکتریاسه و بیشتر برای شمارش E.coli استفاده میشود.
این خانواده گرم منفی، هوازی بی هوازی اختیاری، و محل انتشار آن بیشتر روده ی موجودات خون گرم است.به همین دلیل E.coli به عنوان شاخص بهداشتی مواد غذایی انتخاب شده است. بدین معنی که حضور این میکروارگانیسم در آب یا هر فراورده ی غذایی نشان دهنده ی آلودگی آن محصول است.
از جمله از مهترین محیط های کشت Ecb، EMb، (ائوزین متیلن بلو) و MC konky Agarاست. اساس این محیط ها بر وجود قند لاکتوز و یک ماده ی بازدارنده برای انواع گرم مثبت است. باکتری های این خانواده توانایی هضم لاکتوز را دارند.
بنابراین قند لاکتوز به عنوان منبع انرژی در فرمولاسیون این محیط ها وجود دارد. علاوه بر آن در محیط های EMb ترکیبی مانند ائوزین و نمک های صفراوی نیز وجود دارد.که مانع از تکثیر باکتری های گرم مثبت می شود.
به منظور شمارش باکتری ها به روش MPN ابتدا نمونه توزین شده و به نسبت 1 به 9 با سرم فیزیولوژی رقیق می شود. در تهیه ی رقت ، به سه رقت 1/0 ، 01/0 ، 001/0 ادامه می یابد.
توجه داشته باشید از آن جایی که برای شمارش از محیط مایع استفاده می شود . می توانیم رقت سازی را با خود محیط کشت انجام دهیم. و در روش دیگر رقت سازی در سرم فیزیولوژی کامل شده و مقداری از نمونه به محیط کشت دراز منتقل می شود .
به منظور شمارش محیط کشت در 9 یا 15 لوله تقسیم می شود.در روش 9 تایی از هر کدام از لوله ها (رقت ها) سه لوله تلقیح می شود.( ما در این آزمایش از روش 9 تایی استفاده کردیم.)
سپس لوله های تلقیح شده به انکوباتور انتقال داده می شوند و پس از مدت 24 ساعت و دمای 37درجه سانتیگراد، تعداد لوله های مثبت شمارش می شوند.
برای شناسایی باکتری ها از سه روش چشمی ، دورهام و Ph استفاده می شود.
بعد از مشخص شدن تعداد لوله های مثبت و سپس استفاده از جدول MPN تعدا احتملی باکتری ها را با استفاده از فرمول زیر به دست می آوریم:
تعداد احتمالی باکتری ها = عدد به دست آمده از جدول MPN * عکس رقت میانگین(01/0)
نكات مهم :
1) در گذاشتن محیط کشت ها داخل انکو باتور نباید به درجه ساتیگراد آن مطمئن بود. ابتدا بایستی دماسنج بیرون را با دماسنج درون(که مطمئن تر است.) تطبیق دهیم.
2) ترکیبات محیط کشت ECb :
لاکتوز: قندی است که فقط باکتری های این خانواده قادر به تجزیه ی آن هستند.
تریپتون:پروتئین هیدرولیز شده است. پس منبع ازت است.
نمک صفراوی: از کشت باکتری های گرم مثبت جلوگیری می کند.
دی پتاسیم فسفات و مونو پتاسیم فسفات: بافری کننده ی محیط است. و این عملکرد باعث می شود تا مقدار گاز معین از عملکرد باکتری ها را به دست آوریم.
سدیم کلرید: برای تنظیم فشار اسمزی محیط اضافه می شود.
3) برای شناسایی باکتری ها از سه روش چشمی ، دورهام و Ph استفاده می شود.
4) تعداد احتمالی باکتری ها=عدد به دست آمده از جدول MPN عکس رقت میانگین(01/0)
5) قبل از اقدام به آزمایش از قبل پیپت ها و لوله های آزمایش و ... را داخل اتوکلاو یا آون استریل می کنیم.
مواد و وسايل لازم (Matarials):
اتو کلاو، انکوباتور، شیکر،محیط کشت ECb، سرم فیزیولوژی ، پیپت ، لوله ی آزمایش ، جدولMPN، آب آلوده
روش و شرح آزمايش(Methods) :
محیط کشت ECb را تهیه کرده و سپس آن را در 9 لوله ی آزمایش استریل شده به طور مساوی می ریزیم.( رنگ محلول شفاف و طلایی رنگ است.)
در سه لوله ی آزمایش دیگر نیز به مقدار مساوی سرم فیزیولوژی به میزان 9 میلی لیتر می ریزیم. سپس 1 میلی لیتر از آب آلوده برداشته و به لوله ی اول محتوی سرم فیزیولوژی اضافه می کنیم.
و روی آن با ماژیک عدد 0.1را مرقوم می کنیم. سپس با یک پیپت استریل شده ی دیگر ا میلی لیتر از همان لوله ی آزمایش اولی برداشته و آن را به لوله ی آزمایش دوم محتوی سرم فیزیولوژی اضافه می کنیم.
این بار روی آن عدد 0.01 را یادداشت می کنیم. و در آخر دوباره با یک پیپت استریل شده ی دیگر ا میلی لیتر از لوله ی آزمایش دوم را برداشته و آن را به لوله ی آزمایش سوم محتوی سرم اضافه کرده و عدد 0.001 را می نویسیم.
هم اکنون 3 لوله ی آزمایش محتوی آب آلوده + سرم با غلظت های 0.1، 0.001،0.01 را داریم.
در مرحله ی بعد از هرکدام از این 3 لوله ی آزمایش 3 میلی لیتر برداشته و به سه لوله ی آزمایش حاوی محیط کشت هر کدام یک میلی تر اضافه می کنیم. یعنی در کل 3 تا لوله ی تلقیح شده ی 0.1 ، 3 تا 0.01 و 3 تا هم 0.001 خواهیم داشت. جمعا 9 تا.
بعد از تلقیح لوله ها را داخل انکوباتور (البته بعد از چک کردن آن)به مدت24 ساعت می گذاریم.
چون بعد از 24 ساعت هر 9 لوله کدر شده بودند. بنابراین عدد مربوط به 333 را از جدول استخراج می کنیم.
محاسبات(Calculations):
با توجه به این که عدد بدست آمده برای 333 ، 24 است آن را در فرمول مربوطه جایگذاری کرده و ضرب در عکس رقت میانگین می کنیم. که عدد بدست آمده معادل 2400می شود.
نتايج و بحث (Results and Discution):
1) از آنجایی که این روش شمارش روشی آماری است که از قوانین احتمالات با توجه به نحوه توزیع نمونه در لوله های محیط کشت تبعیت می کند به آن روش MPN می گویند. این اصطلاح از حرف اول سه کلمه Most Probable Number به معنای حداکثر تعداد احتمالی گرفته شده است.
2) یکی از روش های مرسوم و مورد اعتماد برای شمارش باکتری های کلی فرم در نمونه های آبی استفاده از روش تخمیر چندلوله ای یا اصطلاحاً روش MPN است.
3) معمولا این روش برای خانواده ی انتروباکتریاسه و بیشتر برای شمارش E.coli استفاده میشود.
4) برای بدست آوردن تعداد باکتری های احتمالی از فرمول زیر استفاده می کنیم:
تعداد احتمالی باکتری ها = عدد به دست آمده از جدول MPN * عکس رقت میانگین(0.01)
محاسبات:
پس از خارج کردن محیط کشت از انکی باتور جلوی نور محیط کشتها را با شاهد مقایسه میکنیم در صورت کدر شدن محیط کشت نسبت به شاهد، در جدول مانند جدول زیر یک + به معنی رشد باکتری در آن رقت مربوط به نمونه وارد میکنیم.
10-9 10-8 10-7 10-6 10-5 رقتها/ تکرار
+ + + + + 1
+ + + + + 2
+ + + + + 3
+3
منابع:
1- www.az0098.blogfa.com
2- دکتر یوسفی - مطالب عنوان شده در کلاس تئوری
3- علی اصغرزاده . ن -1385 – روش های آزمایشگاهی در بیولوژی خاک – انتشارات دانشگاه تبریز
موضوعات مرتبط: آزمایشگاه بیولوژی خاک